Os resultados com biomarcadores indicam excelente eficácia do(s) seu(s) protótipo(s) eleito(s), em um modelo animal validado da doença alvo.
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Durante o processo de descoberta, é essencial ter prova de eficácia em algum modelo animal da doença alvo. Um modelo animal ideal deveria possuir validade fenotípica (semelhança de aspectos entre o modelo e a doença), validade de construção (mesmo mecanismo ou estado interno subjacente à doença) e validade preditiva (capacidade de identificar tratamentos terapêuticos para a doença humana). A ausência de modelo animal com boa preditividade é uma das causas da falta de translacionalidade de dados para a clínica, sendo responsável por falhas que ocorrem durante os ensaios clínicos, quando não se repete a eficácia observada em modelos celulares ou animais.
Os estudos ADME in vitro indicam que o(s) seu(s) protótipo(s) eleito(s) possui(em) boa estabilidade em hepatócitos humanos, boa permeabilidade celular (células CACO-2 ou MDCK), bom perfil metabólico com identificação do principal CYP envolvido e sem problemas relevantes quanto à inibição de CYPs relevantes.
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Após ter feito uma primeira estimativa de alguns parâmetros farmacocinéticos in silico, com softwares específicos, tais propriedades são avaliadas em células ainda na fase de seleção de protótipos porque tais métodos in vitro são mais rápidos e menos custosos do que os ensaios in vivo, em animais de experimentação.
Estudos ADME in vivo foram realizados em ratos e cães e os dados da administração i.v. e oral são consideradas bons.
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Por força da legislação internacional, estudos farmacocinéticos avaliando estas propriedades devem ser efetuados em duas espécies animais, sendo que uma não pode ser roedor. Estes estudos são geralmente feitos em ratos e cães, quando se estabeleça o perfil da evolução temporal da concentração plasmática após administração por via oral e intravenosa.
Seus protótipos estão livres de citotoxicidade quando testados em hepatócitos humanos e numa célula relevante para a doença alvo.
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O teste de citotoxicidade in vitro é fundamental para selecionar/filtrar as substâncias dentro do processo de descoberta de fármacos. Atualmente, há três tipos principais de ensaios de citotoxicidade adaptáveis para triagem de alto rendimento (HTS). Esses métodos medem a viabilidade celular através de ensaios bioluminescentes de ATP ou a citotoxicidade através de enzimas liberadas no meio de cultura, como a enzima lactato desidrogenase (LDH, acrônimo do inglês Lactate DeHydrogenase).
Idealmente, a substância em teste não deveria ter efeito citotóxico em concentração 50 vezes maior do que o CE50 para efeito alvo, tanto em
células hepáticas (Hep G2) como numa célula relevante para a doença alvo. Hep G2 (ou HepG2) é uma linhagem celular imortal derivada do
tecido hepático de um adolescente com um carcinoma hepático.
Você concluiu o primeiro teste de toxicidade com sucesso, usando um protocolo de escalonamento de dose que leva à determinação da dose máxima tolerada (MTD: Maximum Tolerated Dose) em rato e em um animal não roedor.
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Historicamente, as informações de toxicidade aguda, como o MTD, eram obtidas a partir de estudos de toxicidade de administração única (3 doses, em animais diferentes) em duas espécies de mamíferos, utilizando a via de administração a ser usada na clínica e a via parenteral, havendo observação dos animais durante 14 dias após o tratamento. Contudo, essas informações podem ser obtidas a partir de estudos mais flexíveis de escalonamento de dose ou de estudos DRF de curta duração (DRF: Dose Range Finding).
As doses limites para estudos de toxicidade aguda, subcrônica e crônica de 1000 mg/kg/dia para roedores e não roedores são consideradas apropriadas.
Referência: M3(R2) Nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals (FDA, ICH, 2010).
Os dados do ensaio com linfoma murino in vitro (MLA: Murine Lymphome Assay) indicam que seu protótipo não é genotóxico.
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Os testes de genotoxicidade são realizados ao longo do processo de descoberta de fármacos, sendo cada vez mais preditivos do potencial mutagênico de uma substância no ser humano, iniciando-se geralmente com teste em bactérias (teste de AMES) e depois em células de mamíferos (in vitro e in vivo).
O desenvolvimento farmacêutico terminou após a confirmação de boa solubilidade e estabilidade do fármaco. A síntese em larga escala foi realizada com sucesso e tem a quantidade de princípio ativo suficiente para os estudos pré-clínicos in vivo.
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À medida que os ensaios se sofisticam, passando de testes in vitro para testes em animais de experimentação, as necessidades de quantidades de substância teste aumentam, passando de poucos miligramas para dezenas (ou centenas) de gramas, exigindo uma síntese em escala cada vez maior, necessitando de adaptação quanto à rota e condições de síntese. Há também necessidade de desenvolver uma forma farmacêutica adequada para fazer testes pré-clínicos em condições de boas práticas de laboratório (BPL), que será a mesma a ser utilizada durante os ensaios clínicos.